Определение белка в моче

Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты).

Среди качественных методов определения бедка в моче наибольшее распространение получили унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой и кольцевая проба Геллера.

Унифицированная проба с сульфасалициловой кислотой проводится следующим образом. В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В одну из них прибавляют 6—8 капель 20 % раствора сульфасалициловой кислоты. На темном фоне сравнивают обе пробирки. Помутнение мочи в пробирке с сульфасалициловой кислотой указывает на наличие белка. Перед исследованием необходимо определить реакцию мочи, и если она щелочная, то подкислить 2—3 каплями 10 % раствора уксусной кислоты.

Проба Геллера основана на том, что при наличии белка в моче на границе азотной кислоты и мочи происходит его коагуляция и появляется белое кольцо. В пробирку наливают 1—2 мл 30 % раствора азотной кислоты и осторожно по стенке пробирки наслаивают точно такое же количество профильтрованной мочи. Появление белого кольца на границе двух жидкостей указывает на наличие белка в моче.

1) унифицированный метод Брандберга—Робертса—Стольникова, в основу которого положена кольцевая проба Геллера;
2) фотоэлектроколориметрический метод количественного определения белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфасалициловой кислоты;
3) биуретовый метод.

Выявление белка в моче упрощенным ускоренным методом проводят колориметрическим методом с помощью индикаторной бумаги, которую выпускают фирмы «Lachema» (Словакия), «Albuphan», «Ames» (Англия), «Albustix», «Boehringer» (Германия), «Comburtest» и др. Метод заключается в погружении в мочу специальной бумажной полоски, пропитанной тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером, которая меняет свой цвет от желтого до синего в зависимости от содержания белка в моче.

Ориентировочно концентрацию белка в исследуемой моче определяют с помощью стандартной шкалы. Для получения правильных результатов необходимо соблюдать следующие условия. рН мочи должна быть в пределах 3,0—3,5; при слишком щелочной моче (рН 6,5) будет получен ложноположительный результат, а при слишком кислой моче (рН 3,0) — ложноотрицательный.

Бумага должна находиться в контакте с исследуемой мочой не дольше, чем указано в инструкции, в противном случае тест даст ложноположительную реакцию. Последнюю также наблюдают и при содержании в моче большого количества слизи. Чувствительность различных видов и серий бумаги может быть различной, поэтому к количественной оценке белка в моче этим методом следует относиться осторожно. Определение его количества в суточной моче при помощи индикаторной бумаги невозможно [Плетнева Н.Г., 1987]


Существует несколько способов определения количества белка, выделившегося с мочой за сутки. Наиболее простым является метод Брандберга —Робертса—Стольникова.

К=(х·V)/1000

где К — количество белка в суточной моче (г); х — количество белка в 1 л мочи (г); V — количество мочи, выделенное за сутки (мл).

В норме в течение суток с мочой выделяется от 27 до 150 мг (в среднем 40—80 мг) белка.

Указанная проба позволяет определить в моче только мелкодисперсные белки (альбумины). Более точные количественные методы (колориметрический метод Кьельдаля и др.) довольно сложны и требуют специальной аппаратуры.

При патологическом процессе наблюдаются глубокие нарушения жизнедеятельности клеток, сопровождающиеся выходом внутриклеточных ферментов в жидкостные среды организма. Энзимодиагностика базируется на определении ряда ферментов, выделившихся из клеток пораженных органов и не свойственных сыворотке крови.

Исследования нефрона человека и животных показали, что в отдельных его частях имеется высокая ферментативная дифференциация, тесно связанная с функциями, которые выполняет каждый отдел. В клубочках почки содержится относительно небольшое количество различных энзимов.

Клетки почечных канальцев, особенно проксимальных отделов, содержат максимальное количество энзимов. Высокая их активность наблюдается в петле Генле, прямых канальцах и собирательных трубочках. Изменения активности отдельных энзимов при различных заболеваниях почек зависят от характера, остроты и локализации процесса.

Они наблюдаются до появления морфологических изменений в почках. Поскольку содержание различных ферментов четко локализовано в нефроне, определение того или иного фермента в моче может способствовать топической диагностике патологического процесса в почках (клубочки, канальцы, корковый или мозговой слой), дифференциальной диагностике почечных заболеваний и определению динамики (затухание и обострение) процесса в почечной паренхиме.

Дли дифференциальной диагностики заболеваний органов мочеполовой системы применяют определение активности в крови и моче следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), лейцинаминопептидазы (ЛАП), кислой фосфатазы (КФ), щелочной фосфатазы (ЩФ), β-глюкуронидазы, глютамино-щавелевоуксусной трансаминазы (ГЩТ), альдолазы, трансамидиназы и др.

Энзимурия при заболеваниях почек более выражена и закономерна, чем энзимемия. Она особенно сильно выражена в острой стадии заболевания (острый пиелонефрит, травма, распад опухоли, инфаркт почки и т.д.). При этих заболеваниях обнаруживается высокая активность трансамидиназы, ЛДГ, ЩФ и КФ, гиалуронидазы, ЛАП, а также таких неспецифических энзимов, как ГЩТ, каталаза [Полянцева Л.Р., 1972].

Селективная локализация ферментов в нефроне при обнаружении ЛАП и ЩФ в моче позволяет с уверенностью говорить об острых и хронических заболеваниях почек (острая почечная недостаточность, некроз почечных канальцев, хронический гломерулонефрит) [Шеметов В.Д., 1968]. По данным А.А.Карелина и Л.Р.Полянцевой (1965), трансамидиназа содержится лишь в двух органах — почке и поджелудочной железе.

Дифференциальным тестом в диагностике гломерулонефрита и пиелонефрита Krotkiewski (1963) считает активность ЩФ в моче, повышение которой более характерно для пиелонефрита и диабетического гломерулосклероза, чем для острого и хронического нефрита. Нарастающая в динамике амилаземия при одновременном снижении амилазурии может указывать на нефросклероз и сморщивание почки, ЛАП имеет наибольшее значение при патологических изменениях в клубочках и извитых канальцах почки, поскольку содержание ее в этих отделах нефрона более высокое [Шепотиновский В.П. и др., 1980]. Для диагностики волчаночного нефрита рекомендуется определение β-глюкуронидазы и КФ [Приваленко М.Н. и др., 1974].

PPT - Современные методы диагностики и лечения, применяемые в ...

При оценке роли энзимурии в диагностике заболеваний почек следует учитывать следующие положения. Энзимы, будучи по своей природе белками, при малой молекулярной массе могут проходить через неповрежденные клубочки, определяя так называемую физиологическую энзимурию. Среди этих энзимов постоянно определяются в моче α-амилаза (относительная молекулярная масса 45 ООО) и уропепсин (относительная молекулярная масса 38000).

Наряду с низкомолекулярными энзимами в моче здоровых лиц могут быть обнаружены в небольшой концентрации и другие энзимы: ЛДГ, аспартат- и аланинаминотрансферазы, ЩФ и КФ, мальтаза, альдолаза, липаза, различные протеазы и пептидазы, сульфатаза, каталаза, рибонуклеаза, пероксидаза [King, Воусе, 1963].

Высокомолекулярные энзимы с относительной молекулярной массой больше 70000-100000, по мнению Richterich (1958) и Hess (1962), могут проникать в мочу лишь при нарушении проницаемости клубочкового фильтра. Нормальное содержание ферментов в моче не позволяет исключить патологический процесс в почке при окклюзии мочеточника.

Большинство энзимов неспецифично по отношению к почке, поэтому откуда происходят энзимы, обнаруженные в моче здоровых и больных, установить трудно. Однако степень энзимурии даже дли неспецифичных энзимов при поражении почек бывает выше нормы или той, которая наблюдается при заболеваниях других органов. Более ценную информацию может дать комплексное исследование в динамике ряда ферментов, особенно органоспецифичных, таких как трансаминаза.

В решении вопроса о почечном происхождении энзима в моче помогает исследование изоэнзимов с выявлением фракций, типичных для изучаемого органа. Изоэнзимы — это энзимы, изогенные по действию (катализируют одну и ту же реакцию), но гетерогенные по химической структуре и другим свойствам. Каждая ткань имеет характерный для нее изоэнзимный спектр. Ценными методами разделения изоэнзимов являются электрофорез в крахмальном и полиакриламидном геле, а также ионообменная хроматография.

Методы выявления скрытой лейкоцитурии

С целью определения источника лейкоцитурии и степени активности воспалительного процесса применяется метод суправитальной окраски осадка мочи, который предложили в 1949 г. R.Stemheimer и B.I.Malbin. Штернгеймер и Мальбин показали, что лейкоциты мочи отличаются друг от друга по внешнему виду и в зависимости от морфологических особенностей окрашиваются специальной краской (водно-алкогольная смесь 3 частей генцианвиолета и 97 частей шафранина) либо в красный, либо в бледно-голубой цвет. Лейкоциты, окрашенные в голубой цвет, бывают двух видов.

Лейкоциты первого вида не отличаются от обычных сегментоядерных. Лейкоциты второго вида увеличены в размере в 2— 3 раза, округлой формы, иногда с вакуолизацией протоплазмы. Их ядро многодольчатое или представляется разделенным на 2—3 сферических ядра и обычно темнее протоплазмы. Гранулы протоплазмы этих лейкоцитов находятся в состоянии броуновского движения.

Лейкоциты второго вида принято именовать клетками Штернгеймера—Мальбина. Они представляют собой обычные жизнеспособные сегментоядерные нейтрофильные лейкоциты, проникающие в мочу из очага воспаления в почечной паренхиме и меняющие вид и форму в строго определенных условиях, среди которых наиболее важными являются изменения осмотических свойств мочи и осмотической резистентности лейкоцитов, попавших в мочу.

Клетки Штернгеймера—Мальбина обнаруживают примерно у 50 % больных острым пиелонефритом и у 25 % больных хроническим пиелонефритом. Клетки Штернгеймера—Мальбина не являются патогномоничными для пиелонефрита, поскольку могут содержаться в секрете предстательной железы, выделениях из влагалища. Если попадание в мочу секрета предстательной железы и влагалищного содержимого исключено, то клетки Штернгеймера—Мальбина указывают на наличие неспецифического воспалительного процесса в почке и его активность, так как лейкоциты данного вида практически отсутствуют в моче при остром и хроническом цистите.

Активные лейкоциты

В связи с тем что жизнеспособные лейкоциты превращаются в моче в клетки Штернгеймера-Мальбина лишь при низкой осмотической концентрации и поэтому далеко не всегда могут быть обнаружены. В.С.Рябинский и В.Е.Родоман (1966) предложили методику исследования в осадке мочи активных лейкоцитов. Метод основан на том, что жизнеспособные лейкоциты, попавшие в мочевые пути из очага воспаления в почке, обязательно превращаются в моче с низким осмотическим давлением в крупные клетки с подвижностью гранул их протоплазмы.

Мочу у больных получают при самостоятельном мочеиспускании из средней порции после обработки наружных половых органов и наружного отверстия уретры дезинфицирующим раствором. К осадку центрифугированной мочи добавляют 1 каплю краски следующего состава: эозина — 250 мг, 1 % фенола 2 мл, 40 % формалина 0,5 мл, глицерина 10 мл, дистиллированной воды 87,5 мл. Ю.А.Пытель и С.Б.

При отсутствии клеток Штернгеймера—Мальбина к осадку мочи добавляют равное количество дистиллированной воды, содержимое пробирки смешивают и повторно исследуют под микроскопом спустя 5—7 мин. О наличии активных лейкоцитов свидетельствует появление крупных светло-голубых лейкоцитов с подвижными гранулами в протоплазме.

Особенно важное диагностическое значение активные лейкоциты имеют в серозной стадии острого пиелонефрита, когда в почке отсутствуют деструктивные изменения и незначительная лейкоцитурия обусловлена проникновением жизнеспособных лейкоцитов из очага воспаления в межуточной ткани почки через сохранившие анатомическую целость канальцы в просвет нефрона.

При исследовании осадка мочи больных после трансплантации почек Б.В.Петровский и соавт, (1969) обнаружили преобладание лимфоцитов. В.П.Ситникова и соавт. (1973) отметили, что при пиелонефрите у детей преобладает нейтрофильный профиль лейкоцитурии, а при гломерулонефрите — лимфоцитарный. Это позволяет использовать исследование профиля лейкоцитурии при дифференциальной диагностике различных нефропатий, а также при отличии реакции отторжения от гнойно-воспалительного процесса в пересаженной почке.

Методика исследования заключается в следующем. Собирают среднюю порцию мочи, центрифугируют в течение 5 мин при 2000 об/мин, сливают надосадочную жидкость.

К осадку добавляют 2 капли метанола для предотвращения paзрушения клеток при высушивании. Небольшое количество осадка помещают тонким слоем на предметное стекло. Высушенный мазок фиксируют в метаноле несколько минут и окрашивают в течение 5—10 мин красителем Гимзы. Промытый и высушенный мазок исследуют под иммерсионной системой микроскопа с подсчетом лейкоцитарной формулы.

При наличии активного хронического воспалительного процесса в почке лейкоцитурии и активных лейкоцитов в осадке мочи не отмечается. Отсутствие изменений в моче и клинически выраженного обострения нередко ставит практического врача в затруднительное положение, особенно если нет характерных для хронического пиелонефрита изменений по данным других методов исследования.

В связи с этим с целью выявления скрытой лейкоцитурии стали применять провокационные пробы, которые позволяют получить у больных хроническим пиелонефритом увеличенное количество лейкоцитов в моче. В настоящее время применяют пирогенный, преднизолоновый, парафиновый, нафталановый, озокеритовый и другие провокационные тесты.

Пирогенный тест

Пирогенный тест впервые применили Pears и Houghtorn в 1958 г. Они вводили внутривенно препарат пирексал, который вызывает кратковременную лихорадку и провоцирует выделение лейкоцитов из очага воспаления в почке в мочу. Н.Г.Мкервали (1968) применила в качестве пирогенного вещества пирогенал. Пирогенал вводят внутримышечно в количестве 50 мкг после сбора утренней порции мочи. Затем собирают 3-часовые порции мочи и одну порцию мочи через 24 ч после введения препарата.

В каждой порции определяют количество форменных элементов в 1 мл мочи, а также клетки Штернгеймера—Мальбина, или клетки активных лейкоцитов. В связи с часто возникающими побочными реакциями и осложнениями при введении пирогенных веществ (тяжелая лихорадка, озноб, тошнота, рвота, головные (боли, слабость, артралгии и т.д.) пирогенные тесты не нашли широкого Практического применения.

Кац, Веласкес и Бордо (1962) предложили заменить пирогенный тест преднизолоновым. Они установили, что кортикостероиды, аналогично пирогенным веществам, провоцируют выделение лейкоцитов с мочой. Преднизолоновый тест проводят по следующей методике. Утром собирают среднюю порцию мочи при самостоятельном мочеиспускании.

Определяют количество лейкоцитов и других форменных элементов в 1 мл каждой порции мочи, а также наличие в осадке мочи клеток Штернгеймера—Мальбина, или активных лейкоцитов. Тест считается положительным при содержании свыше 4000 лейкоцитов в 1 мл мочи после введения преднизолона и появлении в осадке мочи клеток Штернгеймера—Мальбина, или активных лейкоцитов.

Н.А. Лопаткин

Пирогенный тест

Селективная протеинурия

4.2. Лабораторные методы исследования

В последние годы появилось понятие селективности протеинурии. В 1955 г. Hardwicke и Squire сформулировали понятие «селективная» и «неселективная» протеинурия, определив, что фильтрация плазменных белков в мочу подчиняется определенной закономерности: чем больше молекулярная масса белка, экскретируемого в мочу, тем меньше его клиренс и тем ниже концентрация его в окончательной моче.

Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи с использованием методов электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле. По результатам этих методов исследования можно судить о селективности протеинурии.

По данным В.С.Махлиной (1975), наиболее оправданным является определение селективности протеинурии путем сравнения клиренсов 6—7 индивидуальных белков плазмы крови (альбумина, транеферрина, α2 — макроглобулина, IgA, IgG, IgM) с использованием точных и специфичных количественных иммунологических методов реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини, иммуноэлектрофоретического анализа и преципитального иммуноэлектрофореза.

Изучение клиренсов индивидуальных плазменных белков позволяет получить достоверные сведения о состоянии фильтрационных базальных мембран клубочков почки. Связь между характером экскретируемых в мочу белков и изменениями базальных мембран клубочков настолько выражена и постоянна, что по уропротеинограмме можно косвенно судить о патофизиологических изменениях в клубочках почек.

При гломерулонефрите, нефротическом синдроме размеры пор в базальных мембранах клубочков увеличиваются, в связи с чем базальная мембрана становится проницаемой для белковых молекул большого размера и массы (церулоплазмин, гаптоглобин, IgG, IgA и др.). При крайней степени повреждения клубочков почек в моче появляются гигантские молекулы белков плазмы крови (α2-макроглобулин, IgM и β2-липопротеин).

Определяя белковый спектр мочи, можно сделать заключение о преимущественном поражении тех или иных участков нефрона. Для гломерулонефрита с преимущественным поражением гломерулярных базальных мембран характерно наличие в моче крупно- и среднемолекулярных белков. Для пиелонефрита с преимущественным поражением базальных мембран канальцев характерны отсутствие крупномолекулярных и наличие повышенных количеств средне- и низкомолекулярных белков.

Методы выявления скрытой лейкоцитурии

Пирогенный тест

Β2-Микроглобулин

Помимо общеизвестных белков, таких как альбумин, иммуноглобулины, липопротеины. фибриноген, трансферрин, в моче содержатся плазменные белки-микропротеины, среди которых клинический интерес представляет β

-микроглобулин, открытый Berggard и Bearn в 1968 г. Имея низкую молекулярную массу (относительная молекулярная масса 1800), он свободно проходит через клубочки почки и почти полностью реабсорбируется в проксимальных канальцах. Это позволяет использовать количественное определение β

-микроглобулина в крови и моче для определения клубочковой фильтрации и способности почек к резорбции протеинов в проксимальных канальцах.

Концентрацию этого белка в плазме крови и моче определяют радиоиммунологическим методом с помощью стандартного набора «Phade-bas β2-mikroiest» (фирма «Pharmaсia», Швеция). В сыворотке крови здоровых людей содержится в среднем 1,7 мг/л (колебания от 0,6 до 3 мг/л), в моче — в среднем 81 мкг/л (максимально 250 мкг/л) β2-микроглобулина.

Превышение его в моче свыше 1000 мкг/л — явление патологическое. Содержание β2-микроглобулина в крови увеличивается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением клубочковой фильтрации, в частности при остром и хроническом гломерулонефрите, поликистозе почек, нефросклерозе, диабетической нефропатии, острой почечной недостаточности.

Концентрация β2-микроглобулина в моче повышается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением реабсорбционной функции канальцев, что приводит к увеличению экскреции его с мочой в 10—50 раз, в частности, при пиелонефрите, ХПН, гнойной интоксикации и др. Характерно, что при цистите в отличие от пиелонефрита не наблюдается увеличения концентрации β2-микроглобулина в моче, что может быть использовано для дифференциальной диагностики этих заболеваний.

Определение белка в моче

Средние молекулы (СМ), иначе называемые белковыми токсинами, представляют собой вещества с молекулярной массой 500—5000 дальтон. Физическая структура их неизвестна. В состав СМ входят по меньшей мере 30 пептидов: окситоцин, вазопрессин, ангиотензин, глюкагон, адренокортикотропный гормон (АКТГ) и др.

Избыточное накопление СМ наблюдается при снижении функции почек и содержании в крови большого количества деформированных белков и их метаболитов. Они обладают разнообразным биологическим действием и нейротоксичны, вызывают вторичную иммунодепрессию, вторичную анемию, угнетают биосинтез белка и эритропоэз, тормозят активность многих ферментов, нарушают течение фаз воспалительного процесса.

Уровень СМ в крови и моче определяют скрининговым тестом, а также путем спектрофотометрии в ультрафиолетовой зоне по длине волны 254 и 280 мм на спектрофотометре ДИ-8Б, а также динамической спектрофотометрии с компьютерной обработкой в диапазоне волн 220—335 нм на том же спектрометре фирмы Beckman. За норму принимают содержание СМ в крови, равное 0,24 ± 0,02 усл. ед.

Неплазменные (тканевые) уропротеины

Кроме белков плазмы крови, в моче могут быть неплазменные (тканевые) протеины. По данным Buxbaum и Franklin (1970), неплазменные белки составляют приблизительно 2/3 всех биоколлоидов мочи и значительную часть уропротеинов при патологической протеинурии. Тканевые белки попадают в мочу непосредственно из почек или органов, анатомически связанных с мочевыми путями, или попадают из других органов и тканей в кровь, а из нее через базальные мембраны клубочков почки — в мочу.

Тканевые протеины в моче выявляют с помощью обычных методов белковой химии (ультрацентрифугирование, гель-хроматография, различные варианты электрофореза), специфических реакций на ферменты и гормоны и иммунологических методов. Последние позволяют также определить концентрацию неплазменного уропротеина в моче и в ряде случаев определить тканевые структуры, ставшие источником его появления.